Parasites & Vecteurs tome 16, Numéro d'article : 62 (2023 ) Citer cet article

Détails des métriques Poudre hydrosoluble de tartrate de tylosine

Les vésicules extracellulaires (VE) libérées par les helminthes jouent un rôle important dans la communication parasite-hôte.Cependant, on sait peu de choses sur les caractéristiques et le contenu des VE de Fasciola gigantica, un ver plat parasite qui cause la fasciolose tropicale.Une meilleure compréhension des véhicules électriques libérés par F. gigantica aidera à élucider le mécanisme de l'interaction F. gigantica-hôte et facilitera la recherche de nouveaux vaccins candidats pour le contrôle et le traitement de la fasciolose.

Deux populations différentes d'EV (EV 15k et EV 100k) ont été purifiées à partir de milieux de culture adultes de F. gigantica par ultracentrifugation.La morphologie et la taille des véhicules électriques purifiés ont été déterminées par microscopie électronique à transmission (MET) et par le système de caractérisation des particules haute performance Zetasizer Nano ZSP.Dans le but d'identifier des marqueurs de diagnostic ou des candidats vaccins potentiels, les protéines des 100 000 véhicules électriques isolés ont été analysées à l'aide de la protéomique basée sur la spectrométrie de masse (LC-MS/MS).Les souris ont ensuite été vaccinées avec des produits excréteurs/sécrétoires (ESP ; appauvri en VE), 15 000 VE, 100 000 VE et la protéine recombinante de choc thermique de F. gigantica 70 (rFg-HSP70) combinée à un adjuvant à l'alun, suivie d'une infection de provocation avec des métacercaires de F. gigantica.La récupération de la douve et les niveaux d'anticorps ont été utilisés comme mesures de la protection vaccinale.

L'analyse TEM et l'analyse de suivi des nanoparticules ont indiqué l'isolement réussi de deux sous-populations d'EV (EV 15k et EV 100k) à partir de surnageants de culture adultes de F. gigantica à l'aide d'une centrifugation différentielle.Un total de 755 protéines ont été identifiées dans les 100 000 véhicules électriques.Les protéines de la biogenèse des exosomes ou du trafic des vésicules, les protéines de la voie ESCRT (complexe de tri endosomal requis pour le transport) et les marqueurs d'exosomes, les protéines de choc thermique et les protéines 14-3-3 ont été identifiées dans les 100 000 véhicules électriques.Ces résultats indiquent que les 100k EV isolés étaient des vésicules ressemblant à des exosomes.Les fonctions des protéines identifiées peuvent être associées à la régulation immunitaire, à l'évasion immunitaire et à la virulence.Les souris immunisées avec F. gigantica ESPs, 15k EVs, 100k EVs et rFg-HSP70 ont présenté une réduction de la charge de douve de 67,90%, 60,38%, 37,73% et 56,6%, respectivement, par rapport au groupe témoin adjuvant.La vaccination de souris avec F. gigantica EVs 100k, EVs 15k, ESP et rFg-HSP70 a induit une production significative d'immunoglobulines spécifiques dans le sérum, à savoir IgG, IgG1 et IgG2a.

Les résultats de cette étude suggèrent que les protéines dans les vésicules de type exosome de F. gigantica ont des fonctions immunomodulatrices, d'évasion immunitaire et de virulence.Ces connaissances pourraient conduire à de nouvelles stratégies d'immunothérapie, de vaccination et de diagnostic de la fasciolose.

Le trématode digénétique, Fasciola gigantica, est un important parasite zoonotique d'origine alimentaire avec une distribution mondiale.L'infection par ce ver plat parasite peut entraîner un manque d'appétit, de la diarrhée, des lésions hépatiques, de l'anémie, une réduction de la prise de poids et une réduction de la production de lait [1].Ces symptômes entraînent des pertes économiques substantielles, en particulier dans les pays en développement, et menacent la santé humaine [2].Fasciola gigantica a développé des adaptations pour établir des infections chroniques par la suppression de l'immunité de l'hôte [3].Plus précisément, les infections à F. gigantica induisent généralement une réponse immunitaire non protectrice T helper 2/cellules T régulatrices (Th2/Treg) et la suppression de la protection fournie par les réponses immunitaires T helper 1 (Th1).Cette réponse pourrait être initiée par la libération de produits excréteurs/sécrétoires (ESP) [4].Les ESP libérés par F. gigantica peuvent réguler directement la différenciation des macrophages, des cellules dendritiques (DC) et des cellules T, et ils ont un effet modulateur sur les DC, favorisant ainsi les réponses Th2/Treg en aval [5, 6].Les ESP de Fasciola gigantica induisent également les macrophages vers un phénotype de macrophage activé alternativement (cellules M2), qui favorise les réponses Th2/Treg [7, 8].

Les vésicules extracellulaires (VE) dérivées d'helminthes jouent un rôle essentiel dans la communication parasite-hôte en transférant le matériel parasitaire à l'hôte [9].Ils peuvent être libérés par le tractus gastro-intestinal ou le système protonéphridial du parasite ou excrétés directement du tégument du parasite et convergés en ESP [10, 11].Les véhicules électriques sont de petites nanoparticules enfermées dans une membrane qui sont libérées par de nombreux organismes, y compris les helminthes parasites et leurs hôtes.Ils contiennent différentes protéines, lipides, ARN messagers et ARN non codants [12, 13].Les EV libérés par un large spectre d'helminthes (par exemple, Fasciola hepatica [14], Opisthorchis viverrini [15], Heligmosomoides polygyrus [16], Schistosoma japonicum [17], Echinococcus multilocularis [18] et Echinococcus granulosus [19]) peuvent moduler la réponse immunitaire de l'hôte ou transport de facteurs de virulence [20].Par exemple, les EV isolés des ESP de H. polygyrus peuvent être assimilés par les macrophages et inhiber l'activation des macrophages par la régulation à la baisse du facteur de nécrose tumorale pro-inflammatoire alpha (TNF-α) et de l'interleukine-6 ​​(IL-6) [21].Opisthorchis viverrini a une forte association avec le cholangiocarcinome, et l'internalisation des VE d'O. viverrini par les cholangiocytes favorise la prolifération cellulaire, la sécrétion d'IL-6 et l'induction de l'expression des protéines associées au cancer [15].Les véhicules électriques libérés par S. japonicum peuvent être absorbés par les cellules immunitaires (y compris les macrophages) et transférés sous forme de cargaison de microARN dans les cellules réceptrices pour la suppression de la production de TNF-α [17].Les VE d'Echinococcus multilocularis peuvent inhiber l'oxyde nitrique (NO) et les cytokines pro-inflammatoires produites par les macrophages RAW264.7 activés [18].Les VE isolées des protoscolèces et des métacestodes d'E. granulosus des surnageants de cultures ont supprimé la maturation des DC et la voie de présentation de l'antigène, ce qui pourrait jouer un rôle dans l'immunomodulation [19].

La composition moléculaire des véhicules électriques sécrétés par F. gigantica peut être impliquée dans la régulation immunitaire de l'hôte et la communication F. gigantica-hôte.Pour une meilleure compréhension de la relation entre F. gigantica et son hôte, nous avons utilisé l'ultracentrifugation différentielle pour isoler deux types d'EV (EV 15k et EV 100k) à partir des surnageants de cultures adultes de F. gigantica.Nous avons également utilisé des analyses protéomiques (chromatographie liquide [LC]–MS/MS) basées sur la spectrométrie de masse (MS) des protéines dans les 100k EV isolés pour démontrer que les 100k EV contenaient plusieurs protéines liées à la régulation immunitaire, à l'évasion immunitaire et à la virulence.Ces protéines sont des marqueurs de diagnostic possibles et des candidats vaccins.Nous montrons également que F. gigantica sécrète des ESP, des EV 15k et des EV 100k qui induisent une immunité protectrice contre l'infection.

Des souris ICR femelles âgées de 5 à 7 semaines ont été achetées auprès de Hunan SJT Laboratory Animal Co., Ltd. (Changshang, Chine) et maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes dans la salle des animaux de laboratoire de l'unité de parasitologie de l'Université du Guangxi, en Chine.

Des parasites adultes de F. gigantica ont été obtenus à partir de la vésicule biliaire de buffles des marais fraîchement tués dans des abattoirs locaux.Les parasites adultes ont été lavés trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis cultivés dans du PBS (1 ver / 1 ml de PBS) à 37 ° C pendant 60 min pour éliminer les contaminants de l'hôte (par exemple, la bile, le tissu hépatique et le sang) du entrailles.Les parasites ont ensuite été incubés dans du milieu de culture RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, USA) contenant 0,1 % de glucose, 100 U de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine (Solarbio, Pékin, Chine), à ​​raison de 1 ver/ml de milieu de culture pour 5h à 37°C.Le surnageant a été récupéré et utilisé pour l'étape suivante.

Les vésicules extracellulaires ont été isolées des milieux de culture de F. gigantica selon le protocole de centrifugation différentielle rapporté par Marcilla et al.[22] avec quelques modifications.En bref, le milieu de culture du parasite a été centrifugé à 300 g pendant 15 min puis à 700 g pendant 30 min pour éliminer les œufs, les cellules et les gros débris cellulaires.Le surnageant a ensuite été centrifugé à 2000 g pendant 45 min à 4 ° C, et le surnageant résultant a été centrifugé à 15 000 g pendant 60 min à 4 ° C pour obtenir 15k EV (principalement des microvésicules).Les surnageants ESP ont ensuite été filtrés à travers une membrane d'ultrafiltration de 0, 22 μm et les surnageants filtrés ont été centrifugés à 100 000 g pendant 90 min à 4 ° C pour sédimenter les 100k EV (EV de type exosome).Les pastilles EV 15k et 100k ont ​​été lavées deux fois avec un grand volume de PBS à la même vitesse élevée.Le surnageant résultant a été concentré à l'aide de tubes Amicon® Ultra-15 de 3 kDa de coupure de poids moléculaire (NMWCO) (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) à 5000 g pendant 4 ° C, puis lavé 3 fois avec du PBS.Les concentrations de protéines des surnageants ESP (appauvris en véhicules électriques) sont constituées d'échantillons filtrés et du perméat 3k.La teneur en protéines a été quantifiée par le kit de dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) (CWBIO, Pékin, Chine), puis stockée à - 80 ° C pour des études ultérieures.

Les véhicules électriques granulés de 15k et les véhicules électriques granulés de 100k ont ​​été positionnés sur des grilles de cuivre recouvertes de formvar (Zhongjingkeyi Technology, Pékin, Chine) et colorées avec de l'acide phosphotungstique à 2% (Solarbi) pendant 1 min et à température ambiante.Les véhicules électriques sur les grilles ont été imagés à l'aide d'un microscope à transmission Hitachi-H7700 (Hitachi, Tokyo, Japon) et exposés à 100 kV.

Pour mesurer la distribution granulométrique des particules dans les échantillons EV, une analyse de suivi des nanoparticules (NTA) a été réalisée à l'aide du système de caractérisation des particules haute performance Zetasizer Nano ZSP (Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni) pour capturer et analyser les données.Les véhicules électriques ont été dilués dans du PBS puis chargés dans la chambre d'échantillon.Pour chaque échantillon, trois mesures ont été effectuées et les données ont été analysées.

L'analyse protéomique a été effectuée sur des EV de F. gigantica 100k, et deux échantillons qui avaient été séparés indépendamment ont été analysés.Les échantillons de protéines EV 100k ont ​​été digérés avec de la trypsine comme décrit par Wu et Liu [23], avec quelques modifications.En bref, environ 60 μg de l'échantillon de 100k EV ont d'abord été réduits avec du dithiothréitol (DTT) 100 mM, puis incubés dans un bain d'eau bouillante pendant 5 min, après quoi 200 μl de tampon UA ​​(urée 8 M, Tris-HCl 150 mM, pH 8,0) a été ajouté et la solution a été mélangée.Le mélange a été transféré dans un dispositif d'ultrafiltration (10 kDa) pour centrifugation, et le surnageant a été éliminé.Ensuite, 100 ul de tampon iodoacétamine (IAA) (IAA 100 mM dans du tampon UA) ont été ajoutés au culot d'échantillon et le mélange a été choqué pendant 1 min.Les échantillons ont été incubés pendant 30 min dans l'obscurité à température ambiante, après quoi 100 µl de tampon UA ​​ont été ajoutés et centrifugés ;cette procédure a été répétée deux fois.Puis 100 µl de NH4HCO3 25 mM ont été ajoutés et le mélange centrifugé ;cette procédure a été répétée deux fois.Les protéines ont ensuite été incubées avec 5 μg de trypsine dans 40 μl de NH4HCO3 100 mM à 37 ° C pendant 18 h, puis centrifugées.Enfin, 40 µl de 25 mM de NH4HCO3 ont été ajoutés, et le mélange a été centrifugé et acidifié.Les produits de digestion ont été collectés pour une analyse ultérieure.Selon les résultats quantitatifs, 3 µg des peptides digérés ont été analysés par LC-MS/MS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Les peptides digérés pré-équilibrés avec le tampon A (solution aqueuse d'acide formique à 0,1 % v/v) ont été ajoutés à une colonne C18 EASY de 5 μm (2 × 100 μm ; Thermo Fisher Scientific) et séparés avec un gradient linéaire de tampon B (0,1 % v/v d'acide formique dans une solution aqueuse d'acétonitrile à 84 % v/v) sur une colonne 3 μm-C18 EASY (colonne C18 75 μm × 100 mm 3 μm ; Thermo Fisher Scientific).Le système Easy nLC (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour délivrer le tampon A et le tampon B avec un gradient linéaire de 0 à 55 % (0 à 110 min), 55 à 100 % (110 à 115 min) et maintenu à 100 % ( 115–120 min), à un débit de 300 nl/min.Les données de balayage MS ont été acquises à l'aide du spectromètre Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific), et les 20 ions précurseurs les plus abondants du balayage d'enquête (300–1800 m/z) ont été sélectionnés pour une fragmentation par dissociation collisionnelle à plus haute énergie.La cible de contrôle automatique de gain (AGC) a été fixée à 3e6, le temps d'injection maximal (IT) était de 50 ms et la durée d'exclusion dynamique était de 60,0 s.À l'aide d'un contrôle de gain automatique prédictif, les balayages ont été acquis à une résolution de 70 000 à m/z 200 avec une durée d'exclusion dynamique de 60 s, et la valeur cible a été déterminée pour les balayages complets.La résolution des spectres de dissociation collisionnelle à haute énergie a été fixée à 17 500 à m/z 200, avec une fenêtre d'isolement à 2 m/z.L'énergie de collision normalisée a été fixée à 27 eV et le taux de sous-remplissage a été défini à 0,1 %.

La base de données FASTA provenait de F. hepatica (composée de 26 283 entrées, téléchargées le 10 janvier 2020) et de F. gigantica (composée de 13 094 entrées) obtenues auprès d'UniProt (https://www.uniprot.org/) ont été utilisées pour la analyse des données de spectrométrie de masse EV via Proteome Discoverer 2.2 (Thermo Fisher Scientific).Seules les protéines avec au moins trois peptides ont été considérées comme positivement identifiées.

La séquence complète de la protéine de choc thermique 70 (HSP70) (GenBank : ABS52703.1) de F. gigantica a été obtenue à partir de la base de données GenBank.Pour produire HSP70, la séquence du gène F. gigantica HSP70 a d'abord été synthétisée ;après optimisation des codons, la séquence du gène a été clonée dans un vecteur pET28a (+) en utilisant les sites de clonage BamHI et Xhol.Le vecteur d'expression pET28a(+) a été transformé dans des cellules compétentes d'Escherichia coli BL21 (DE3) et induit avec 0,1 mM d'isopropylthio-β-galactoside (IPTG) (Solarbio) à 30 °C pendant 8 h.La HSP70 recombinante de F. gigantica (rFg-HSP70) a été purifiée par chromatographie d'affinité à l'aide d'un kit de purification de protéines His-tag (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Chine).Des lapins blancs de Nouvelle-Zélande ont été immunisés avec rFg-HSP70 pour produire des anticorps polyclonaux contre rFg-HSP70, en utilisant la méthode décrite par Anuracpreeda et al.[24].

Les véhicules électriques de 15k et 100k (dans des échantillons de 20 ug) ont été chargés sur un gel d'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide à 15% (SDS-PAGE) pour la séparation.Les produits protéiques ont été transférés sur des membranes de difluorure de polyvinylidène de 0,45 µm (MilliporeSigma).Les membranes ont été bloquées avec une solution de blocage (PBST : PBS, 0,05 % de Tween-20, 5 % de lait en poudre écrémé) pendant 4 h à température ambiante, suivies d'une incubation d'une nuit à 4 °C avec un anticorps monoclonal de lapin anti-CD63 humain ( dilution 1:500 ; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la leucine amino peptidase (LAP) de F. gigantica, HSP70 et 14-3-3 epsilon (dilution 1:200).Les anticorps ont été préalablement préparés dans notre laboratoire [25].Les membranes ont ensuite été lavées 5 fois pendant 10 min à chaque fois avec du PBST, suivi d'une incubation pendant 4 h à 4 ° C avec l'immunoglobuline G anti-souris de chèvre secondaire (IgG; (dilution 1: 5000; Abcam) conjugué à la peroxydase de raifort Après cinq lavages de 10 min chacun avec du PBST pour l'imagerie par chimiluminescence avec un kit BeyoECL Plus (Beyotime), les membranes ont été visualisées à l'aide de l'imageur ImageQuant LAS 500 (Cytiva, Marlborough, MA, USA).

Quarante souris ICR femelles âgées de 7 semaines ont été réparties au hasard en cinq groupes (8 souris/groupe) : (i) un groupe non immunisé et non infecté (groupe blanc) ;(ii) un groupe infecté immunisé avec PBS + adjuvant alun (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) (groupe Alum + PBS) ;(iii) un groupe infecté immunisé avec 200 µg d'ESP (appauvri en EVs) + adjuvant alun (groupe Alum + ESP) ;(4) un groupe infecté immunisé avec 200 μg de 15k EVs + adjuvant alun (groupe Alum + 15k EVs);(v) un groupe infecté immunisé avec 200 μg de 100k EVs + adjuvant alun (groupe Alum + 100k EVs);et (vi) un groupe infecté immunisé avec 200 µg de rFg-HSP70 + adjuvant alun (groupe Alum + rHSP70).Les souris ont été maintenues dans la salle des animaux de laboratoire de l'unité de parasitologie, Université du Guangxi, Chine.Toutes les procédures expérimentales animales ont été réalisées conformément au guide des National Institutes of Health pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publication No. 8023, révisé 1978).Les souris ont été gardées dans des cages en acier dans une pièce climatisée à 23 ± 2 ° C, sous une photopériode de 12: 12 h (L / D) et une humidité relative de 50 à 60%.Les vaccins ont été injectés par voie intrapéritonéale aux jours 0, 14 et 28. Les souris traitées ont été provoquées avec 15 métacercaires de F. gigantica par voie orale, au jour 42. Au jour 28 après la provocation, les souris ont été sacrifiées à l'aide de CO2 et des échantillons de sang ont été prélevés. prélevé pour le sérum par ponction cardiaque.Les cavités péritonéales ont été ouvertes et lavées avec du PBS.Des foies entiers ont été prélevés pour déterminer le nombre de douves de F. gigantica (Fig. 4).

Le pourcentage de réduction de la récupération du ver F. gigantica a été calculé comme décrit précédemment [26].Réduction de vers (%) = (A - B)/A) × 100 %, où A = charge de vers immunisée avec du PBS + groupe adjuvant alun et B = charge de vers dans le groupe immunisé provoqué.

Des IgG, IgG1 et IgG2a spécifiques contre les EV de F. gigantica 15k, les EV de F. gigantica 100k ou les ESP de F. gigantica ont été réalisées par dosage immuno-enzymatique indirect (ELISA) comme décrit précédemment [3].La réponse sérique des anticorps IgG, IgG1 et IgG2a contre F. gigantica 15k EVs, 100k EVs et ESPs a été mesurée, en triple, pour chaque groupe par ELISA indirect.

Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) et les analyses ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism version 6.01 (GraphPad Software Inc., San Diego, Californie, États-Unis).L'analyse statistique a été évaluée par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test post hoc de Tukey ou du test t de Student.P < 0,05 indique une signification statistique (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).

Nous avons utilisé le kit BCA pour déterminer les contributions relatives des EV 15k, EV 100k et du surnageant ESP à la quantité totale de protéines sécrétées par F. gigantica adulte.Nous avons constaté que F. gigantica sécrétait des protéines totales à un taux de 64,3 μg/douve/h (100 %).Un taux de sécrétion de 2,85 μg/fluke/h (4,4 %) était associé aux VE de 15 k et un taux de sécrétion de 1,3 μg/fluke/h (2,0 %) était associé aux VE de 100 k ;cependant, la majorité des protéines solubles (> 90 %) sont restées dans l'ESP.Les résultats des études de microscopie électronique à transmission (TEM) et NTA ont confirmé que nous avions réussi à isoler deux types différents de véhicules électriques à partir des milieux de culture de F. gigantica.Les culots de la centrifugation à 15 000 g variaient de 91, 28 nm à 825 nm de diamètre, la plupart des vésicules (> 74%) dépassant 200 nm (Fig. 1c) et présentant des caractéristiques typiques des microvésicules (Fig. 1a).Les culots de la centrifugation à 100 000 g étaient composés de vésicules dont le diamètre variait de 43,82 à 396,1 nm, la plupart des vésicules (> 86 %) ayant un diamètre < 200 nm (Fig. 1c) et des structures en forme de coupe (Fig. 1b) .

Identification de différentes vésicules extracellulaires (VE) de Fasciola gigantica.a, b Caractérisation morphologique par TEM par TEM de 15k EV et 100k EV libérés par F. gigantica adulte.Les pointes de flèches indiquent les véhicules électriques colorés avec 2 % d'acide phosphotungstique.c Distribution de diamètre des EV 15k purifiés et EV 100k de F. gigantica adulte.Les résultats représentent les données de trois préparations indépendantes de F. gigantica 15k EV et 100k EV analysées par le système de caractérisation des particules haute performance Zetasizer Nano ZSP.d Analyse Western blot de F. gigantica 15k EVs et 100k EVs en utilisant des anticorps contre F. gigantica leucine amino peptidase (LAP), heat shock protein 70 (HSP70), 14-3-3epsilon (14-3-3e), énolase et humain CD63.TEM, Microscopie électronique à transmission

Un total de 705 protéines ont été identifiées (≥ 3 peptides uniques appariés) à partir de 100k EV dérivés de F. gigantica (fichier supplémentaire 1 : tableau S1).Parmi les protéines identifiées, les protéines les plus abondantes étaient la dynéine chaîne lourde 1 cytosolique, l'otoferline, la myoferline, la protéine interagissant avec la mort cellulaire programmée 6, la protéine vacuolaire associée au tri des protéines 4, l'endocytose médiée par les récepteurs, la sérine/thréonine-protéine kinase PAK et la leucine aminopeptidase (tableau 1).De nombreuses protéines qui ont été observées dans les exosomes, telles que la biogenèse des exosomes ou les protéines de trafic des vésicules (annexine, membres de la famille des tétraspanines, sphingomyélinase acide, myoferline, otoferline, protéine de corps multivésiculaire chargée, membres de la famille Rab, tri des protéines vacuolaires 26, synténine), tri endosomal complexe requis pour le transport (ESCRT ; y compris la sous-unité complexe ESCRT-II, les protéines de corps multivésiculaires chargées, la protéine IST1, la synténine), les protéines de choc thermique et le 14-3-3 [11, 27], ont été identifiés dans les véhicules électriques de 100 000 k dérivés de F. gigantica (Fichier complémentaire 1 : Tableau S1).Parmi ces protéines, HSP70, CD63, 14-3-3, l'annexine et la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), qui se trouvent généralement dans les exosomes d'helminthes comme les véhicules électriques, ont été identifiées (Fig. 1d; Tableau 1).L'identification de ces protéines indique l'isolement réussi de vésicules ressemblant à des exosomes à partir de surnageants de culture de F. gigantica adultes.Plusieurs protéines identifiées dans les 100k EV ont déjà été caractérisées comme de possibles candidats vaccins contre la fasciolose, notamment la cathepsine L [28], la leucine aminopeptidase [29], 14-3-3 [30], la protéine de liaison aux acides gras (FABP) [31] , la phosphoglycérate kinase [32], la cathepsine B [33] et la tétraspanine 2 (-TSP2) [34], mais avec des efficacités protectrices différentes.

À la suite d'une analyse d'ontologie génique (GO), les termes GO les plus représentés dans la catégorie des processus biologiques dans les protéines EV de F. gigantica 100k ont ​​été attribués comme « protéolyse impliquée dans le processus catabolique des protéines cellulaires », « processus catabolique des protéines cellulaires » et « composé organoazoté ». processus catabolique » (Fig. 2a).De même, les termes GO les plus représentés dans la catégorie fonction moléculaire étaient «liaison guanyl ribonucléotide», «liaison nucléoside purine», «liaison ribonucléoside purine» et «liaison GTP» (Fig. 2b).Les termes «complexe central du protéasome», «cytoplasme», «complexe central du protéasome», «complexe de sous-unité alpha» et «espace extracellulaire» ont été classés dans la catégorie «composant cellulaire» (Fig. 2c).

Ontologie génique (GO) de la cargaison de protéines enrichie en véhicules électriques 100 000 dérivés de F. gigantica.a Termes du processus biologique GO des EV 100k dérivés de F. gigantica adultes, b Termes de la fonction moléculaire GO des EV 100k adultes dérivés de F. gigantica, c Termes des composants cellulaires GO des EV 100k adultes dérivés de F. gigantica.La taille et la couleur du cercle représentent le nombre de gènes et la valeur P

Les données protéomiques ont indiqué que bon nombre des protéines présentes dans les véhicules électriques 100k sécrétés par F. gigantica sont des vaccins candidats connus.Nous avons testé si l'immunisation avec des ESP de F. gigantica (appauvri en EV), des EV de 15k, des EV de 100k et rFg-HSP70 (Fig. 3) pouvait induire une immunité protectrice in vivo.Après la vaccination et la provocation subséquente de métacercaires par F. gigantica, des lésions hépatiques macroscopiques sont apparues, qui étaient similaires chez toutes les souris infectées.Ces lésions étaient caractérisées par des taches de fibrose, des étendues et plaques tortueuses blanchâtres et des dépôts épaissis et calcifiés en surface (Fig. 4).Une réduction représentative de la zone de lésion hépatique a été observée chez les souris après vaccination avec des ESP, des EV de 15 000, des EV de 100 000 et la vaccination rFg-HSP70 (Fig. 4).Les souris immunisées avec 100k EVs, 15k EVs et ESPs ont également montré une réduction marquée de la charge de douve par rapport aux groupes témoins adjuvants.Les pourcentages de protection étaient de 37,73 % (ANOVA unidirectionnelle, F(4, 35) = 7,345, P = 0,0402) pour les véhicules électriques de F. gigantica 100k, 60,38 % (ANOVA unidirectionnelle, F(4, 35) = 7,345, P = 0,0006) pour F. gigantica EV 15k, 67,90 % (ANOVA unidirectionnelle, F(4, 35) = 7,345, P = 0,0001) pour F. gigantica ESP et 56,6 % pour rFg-HSP 70 (ANOVA unidirectionnelle , F(4, 35) = 7,345, P = 0,0013) (Fig. 5).

Expression et purification de la protéine de choc thermique recombinante de F. gigantica 70 (rFg-HSP70).Pistes : M, marqueur protéique ;1, produits d'expression surnageants de pET-28a induits par l'isopropylthio-β-galactoside (IPTG) ;2, corps d'inclusion de pET-28a induit par les produits d'expression IPTG ;3, produits d'expression surnageants de pET-28a-FgHSP70 induits par IPTG ;4, 5, purification de rFg-HSP70 (flèche)

Les véhicules électriques stimulent l'immunité protectrice contre le défi des métacercaires de F. gigantica chez les souris ICR.Des souris ICR femelles, n = 8 par groupe, ont été vaccinées (par voie intrapéritonéale [IP]) avec 15 000 EV, 100 000 EV, ESP, rFg-HSP70 ou PBS dans un adjuvant à l'alun avant la provocation avec 15 métacercaires de F. gigantica.Sont présentées des images représentatives de lésions pathologiques macroscopiques dans le foie de souris infectées récupérées 4 semaines après l'infection.Groupes : Alun : ESP, groupe immunisé et infecté par l'ESP ;Alun : 15 000 EV, groupe 15 000 EV immunisé et infecté ;Alun : 100 000 EV, groupe 100 000 EV immunisé et infecté ;Alum: HSP70, groupe immunisé et infecté par rFg-HSP70 ;Alun : PBS, groupe témoin infecté par l'adjuvant ;Groupe vierge, non vacciné et non infecté.ESP, produits d'excrétion/sécrétion

La charge de douve de chaque souris ICR a été enregistrée 28 jours après l'infection (n = 8).Les astérisques indiquent le niveau de signification entre les groupes : *P < 0,05, **P< 0,01, ***P < 0,001.N.-É., non significatif

Les anticorps sériques anti-parasites spécifiques IgG1 et IgG2a sont souvent utilisés comme indices de référence de résistance ou de chronicité lors d'une infection à F. gigantica [26, 33].Les souris ICR vaccinées avec 15k EV, 100k EV et ESP ont montré une augmentation significative des taux d'IgG spécifiques au sérum (Fig. 6a – c), IgG1 (Fig. 6d – f) et IgG2 (Fig. 6g – i) par rapport à l'adjuvant groupe témoin et le groupe témoin.Les souris immunisées avec 100 000 VE ont produit des niveaux distincts de 15 000 VE et d'IgG, IgG1 et IgG2 sensibles à l'ESP.De même, les sérums de souris vaccinées avec des EV de 15k ou des ESP de F. gigantica contenaient à la fois des IgG, des IgG1 et des IgG2 réactifs aux EV de F. gigantica 15k, des EV de F. gigantica 100k et des ESP de F. gigantica, ce qui indique qu'ils peuvent partager des composants protéiques homologues.Cependant, il n'y avait pas de différence significative dans les IgG2a spécifiques entre le groupe témoin adjuvant et le groupe non infecté.Les IgG2a peuvent représenter la réponse immunitaire de type Th1 dans une certaine mesure, et l'induction de la réponse immunitaire de type Th1 et un niveau élevé d'IgG2a sont essentiels à la protection vaccinale.

Niveaux sériques d'IgG, IgG1, IgG2a chez la souris ICR vaccinée.Les taux sériques d'IgG (a–c), IgG1(d–f) et IgG2a (g–i) ont été mesurés dans les groupes vaccinés (souris immunisées avec 15k EVs, 100k EVs, ESPs et PBS dans l'adjuvant d'alun avant le challenge avec 15 F . gigantica metacercariae) et groupe non immunisé et non infecté.Les niveaux moyens d'IgG (a–c), IgG1 (d–f) et IgG2a (g–i) ont été mesurés par rapport aux ESP (a, d, g), 15 000 EV (b, e, h) et 100 000 EV (c, f , i) par dosage immuno-enzymatique indirect.Les résultats représentent l'absorbance moyenne mesurée à 450 nm pour chaque groupe.Les astérisques indiquent le niveau de signification entre les groupes : *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.N.-É., non significatif

L'analyse TEM et l'analyse de suivi des nanoparticules ont indiqué l'isolement réussi de deux sous-populations d'EV à partir de surnageants de culture adultes de F. gigantica à l'aide d'une centrifugation différentielle.Parmi ceux-ci, 15k EV variaient de 91,28 à 825 nm de diamètre, et la majorité (> 200 nm) avaient des caractéristiques typiques des microvésicules [35], et les 100k EV variaient de 43,82 à 396,1 nm de diamètre et étaient principalement < 200 nm en diamètre, avec des structures typiques en forme de coupe.Ces caractéristiques sont similaires à celles enregistrées dans nos études précédentes F. gigantica 110k EVs [36] et des vésicules de type exosome 120k précédemment rapportées isolées de F. hepatica [37].La taille et les caractéristiques des 100k EV sont comparables aux vésicules de type exosome isolées d'autres trématodes, nématodes et cestodes.Les dimensions des vésicules de type exosome obtenues à partir de F. hepatica variaient de 37 à 153 nm [37].Chez Schistosoma mansoni, les valeurs comparables étaient de 50 à 130 nm [38] ;chez O. viverrini, 40–180 nm [15] ;chez Nippostrongylus brasiliensis, 60–160 nm [39] ;chez Trichuris muris 30–150 nm [40] ;chez Brugia malayi, 85–200 nm [41] ;chez Ascaris suum, 80–200 nm [42] et chez E. granulosus, 50–350 nm [43].L'analyse NTA a montré que les EV de F. hepatica 120k et les EV de F. gigantica 110k sont plus petits que les EV de 100k [11].Nous suggérons que la centrifugation à 100 000 g peut entraîner la perte de certains petits véhicules électriques de type exosome.La biogenèse des exosomes ou les protéines de trafic des vésicules, les protéines de la voie ESCRT ainsi que les marqueurs d'exosomes, les protéines de choc thermique et le 14-3-3 ont été identifiés dans 100 000 véhicules électriques au cours de l'analyse protéomique.Ces résultats indiquent un isolement réussi de vésicules ressemblant à des exosomes à partir de surnageants de culture de F. gigantica adultes.

Nous avons identifié plusieurs protéases, telles que la légumaine, la cathepsine Bs, la cathepsine Ls, la sous-unité alpha du protéasome, la sous-unité bêta du protéasome, la sous-unité alpha du protéasome, l'aminopeptidase, la serpine et la cystatine.Les protéases produites par les helminthes sont essentielles au succès de l'invasion des tissus pendant la migration [44, 45], la dégradation de l'hémoglobine pour la transformation des aliments, la dégradation des IgG pour prévenir la réponse de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) [46], la dégradation de l'immunité les récepteurs de surface cellulaire [47] et la signalisation intracellulaire [48] pour les modulateurs immunitaires.Nous avons également identifié des enzymes glycolytiques dans les véhicules électriques de 100k, y compris la triose phosphate isomérase, la GAPDH, la phosphoglycérate kinase, la phosphoglycérate mutase et la glucose-6-phosphate isomérase.Les enzymes glycolytiques sont impliquées dans la génération d'ATP et de NADH, qui permettent aux helminthes d'obtenir de l'énergie [49].En plus de leur rôle dans la glycolyse, les enzymes glycolytiques peuvent fonctionner dans une variété d'autres fonctions biologiques, telles que l'invasion immunitaire, la virulence et l'immunorégulation [50].Veamurthy et al.[51] ont découvert que la GAPDH sécrétée par Haemonchus contortus pouvait se lier au complément C3, ce qui peut inhiber l'activation du complément et la formation d'un complexe d'attaque membranaire, provoquant ainsi une immunosuppression.La GAPDH exprimée à la surface du sporozoïte de Plasmodium se lie au récepteur CD68 à la surface des cellules de Kupffer, favorisant l'invasion du foie par les sporozoïtes [52].Ces observations indiquent que les enzymes glycolytiques dans les véhicules électriques de 100k sont des candidats vaccins possibles contre la fasciolase.Les GAPDH d'O. volvulus [53], S. mansoni [54] et E. multilocularis [55] ont été évalués comme des vaccins à haute efficacité.

Dans les véhicules électriques de F. gigantica 100k, certaines protéines pouvant se lier au sérum positif de F. gigantica provenant de buffles infectés ont également été trouvées, notamment la tubuline alpha, la protéine transporteur de glucose-2, la glutathion S-transférase, la phosphoglycérate kinase, la cathepsine B5, la cathepsine L, protéine de liaison au calcium, HSP70, kunitz, protéine 14-3-3, leucine amino peptidase, cystatine multidomaine, protéine de type saposine sécrétée SAP-3 et thiorédoxine [56].Liu et al.[57] ont découvert que les ESP de F. hepatica pouvaient se lier aux cytokines liées à Th1 (IL-2 et interféron gamma [IFN-γ]) et à la cytokine liée à Th17 (IL-17).Nous avons également identifié ces protéines dans notre analyse du protéome.Des protéines telles que l'annexine, la phosphoénolpyruvate carboxykinase et la fructose-bisphosphate aldolase se lient à l'IL-2 ;la phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 4-phosphatase et la fructose-bisphosphate aldolase se lient à l'IFN-γ;et la glutathion S-transférase, la severine, l'annexine, la protéine grb2 contenant Sh3 et l'enzyme malique se lient à l'IL-17.Une telle liaison suggère que ces protéines se lient aux cytokines pro-inflammatoires de l'hôte et désactivent ces cytokines.C'est également une partie importante de l'évasion immunitaire des parasites.Ces données suggèrent que ces protéines pourraient être des marqueurs diagnostiques potentiels ou des candidats vaccins.

HSP70 est une fraction riche en EV, et nous avons trouvé une grande quantité de HSP70 dans les données protéomiques.HSP70 est un chaperon moléculaire hautement conservé qui joue un rôle essentiel dans l'homéostasie lors de l'invasion de l'hôte et aide les parasites à s'adapter à des environnements en évolution rapide [58, 59].Les HSP70 des helminthes sont considérés comme des candidats vaccins prometteurs [60, 61].HS70 peut également être utilisé comme conjugué antigénique adjuvant pour induire une immunité spécifique à un antigène spécifique [62, 63].Cependant, la mesure dans laquelle F. gigantica HSP70 peut induire une réponse immunitaire protectrice reste incertaine.La réduction du fardeau de la douve est un paramètre clé pour évaluer l'efficacité du vaccin après un défi avec F. gigantica metacercariae.Dans cette étude, nous avons démontré que la vaccination avec F. gigantica 100k EVs, 15k EVs, ESP (appauvri en EVs) et rFg-HSP70 peut induire une immunité protectrice contre une infection ultérieure à F. gigantica.Les souris immunisées avec des ESP, 15 000 EV, 100 000 EV et rFg-HSP70 ont montré des réductions significatives (P < 0,05) de la charge de la douve, ce qui a induit un niveau significatif de protection de 67,9 %, 60,4 %, 37,7 % et 56,6 %, respectivement.Les ESP de Fasciola gigantica, les EV 15k et les EV 100k induisent des niveaux élevés d'anticorps IgG, IgG1 et IgG2a spécifiques à l'antigène chez la souris.Il est possible que des protéines communes soient partagées entre F. gigantica 100k EVs, 15k EVs et ESPs.Des résultats similaires ont été trouvés dans des études sur F. hepatica [11], H. polygyrus [21] et Echinostoma caproni [64], démontrant que des protéines se chevauchant étaient présentes dans les VE et les ESP isolés de ces helminthes.L'anticorps IgG2a sensible à l'antigène pourrait également être important pour la résistance en aval lors de l'infection par F. gigantica.Des réponses d'anticorps IgG2a plus élevées ont été associées à des charges de douve plus faibles chez Fasciola spp.la recherche sur les vaccins [33, 65, 66], suggérant que la réponse Th1 pourrait être associée à une protection contre la fasciolose.

Nous avons purifié et caractérisé la composition protéomique des vésicules ressemblant à des exosomes à partir de milieux de culture de F. gigantica.Les vésicules de type exosome de Fasciola gigantica contenant des protéines peuvent être liées à l'immunomodulation, à l'évasion immunitaire et à la virulence.La vaccination avec des vésicules ressemblant à des exosomes de F. gigantica a protégé les souris contre une infection ultérieure par des métacercaires de F. gigantica.Nos résultats peuvent fournir de bonnes informations sur de nouvelles stratégies pour l'immunothérapie, la vaccination et le diagnostic de la fasciolose.

Les ensembles de données à l'appui des conclusions de cet article sont inclus dans le document et ses documents supplémentaires.

Réponse de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps

Produits d'excrétion/sécrétion

Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase

Protéine de choc thermique 70

Chromatographie liquidespectrométrie de masse en tandem

Analyse de suivi des nanoparticules

Solution saline tamponnée au phosphate

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécylsulfate de sodium

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Nous remercions le professeur Xingquan Zhu pour son assistance académique et technique.

Le travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31760728), Guangxi Basic Scientific Research Project (No. 16-3), Guangxi Agricultural Science and Technology Project (Z202220), Lin He's Academician Workstation of New Medicine and Traduction clinique à l'Université médicale de Jining (JYHL2019 ZD03, JYHL2021 MS22), Programme de formation de premier cycle pour l'innovation et l'entrepreneuriat de l'Université médicale de Jining (cx2021147) et Programme clé de recherche et développement du Guangxi (AB16380106).

Zhao-An Sheng, Cui-Lan Wu et Dong-Ying Wang ont contribué à parts égales à ce travail

Institut d'oncologie, Académie des sciences médicales du Guangxi, Nanning, Guangxi

Collèges et universités du Guangxi Laboratoire clé de prévention et de contrôle des maladies animales, Collège des sciences et technologies animales, Université du Guangxi, Nanning, République populaire de Chine

Zhao-An Sheng, Dong-Ying Wang, Xi Yang, Guo-Shun Rao, Wei-Yi Huang et Hong-Lin Luo

Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Guangxi Veterinary Research Institute, Nanning, Guangxi, République populaire de Chine

Cui-Lan Wu, Shu-Hong Zhong, Hao Peng, Shi-Wen Feng et Jun Li

Département de biologie pathogène, Jining Medical University, Shandong, République populaire de Chine

Centre de prévention et de contrôle des maladies animales de Yuxi, Yuxi, République populaire de Chine

Key Laboratory of China (Guangxi)-ASEAN Cross-Border Animal Disease Prevention and Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China, Nanning, Guangxi, République populaire de Chine

Cui-Lan Wu, Shu-Hong Zhong, Hao Peng, Shi-Wen Feng et Jun Li

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ZAS, WYH et HLL ont conçu et conçu les expériences.ZAS, CLW et DYW ont réalisé la majorité des expériences.SHZ, XY, GSR, HP, SWF et JL ont contribué à l'acquisition des données.ZAS, HLL, JL et WYH ont rédigé l'article.Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Jun Li, Wei-Yi Huang ou Hong-Lin Luo.

Tous les animaux de laboratoire ont été réalisés conformément aux procédures d'éthique animale et aux directives pour l'utilisation et le soin des animaux de laboratoire de la République populaire de Chine.Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité d'éthique de l'université du Guangxi et le département des sciences et technologies de la province du Hunan (numéro de permis : SYXK 2019-0017).

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

: Tableau S1.Liste des protéines identifiées par MS à partir d'EV isolées à partir de surnageants de culture de F. gigantica adultes.

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Sheng, ZA., Wu, CL., Wang, DY.et coll.L'analyse protéomique des vésicules ressemblant à des exosomes du ver adulte Fasciola gigantica fournit un support pour de nouvelles cibles vaccinales contre la fasciolase.Vecteurs parasites 16, 62 (2023).https://doi.org/10.1186/s13071-023-05659-7

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DOI : https://doi.org/10.1186/s13071-023-05659-7

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